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冈崎片段
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更新时间:2022-12-06 08:20:36
问题描述:

冈崎片段

何扬帆回答:
  抄了一段,将就看吧.   冈崎片段(Okazakifragment):相对比较短的DNA链(大约1000核苷酸残基),是在DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段,这是ReijiOkazaki在DNA合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到的.   DNA复制过程中,2条新生链都只能从5端向3端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成.这些分段合成的新生DNA片段称冈崎片段.细菌冈崎片段长度1000-2000核苷酸,真核生物冈崎片段长度100-200核苷酸.在连续合成的前导链中,U-糖苷酶和AP内切酶也会在错配碱基U处切断前导链.   任何一种DNA聚合酶合成方向都是从5'向3'方向延伸,而DNA模板链是反向平行的双链,这样在一条链上,DNA合成方向和复制移动方向相同(前导链),而在另一条模板上却是相反的(后滞链).那么在复制叉中新链是如何合成的呢?1968年冈崎(Okazaki)及其同事进行了一系列实验,回答了这一问题.   他们做了两组实验,一组是脉冲标记实验(pulse-labelingexperiment).以E.coli为材料,在培养时,培养基中加入同位素[3H]标记的dTTP,经30秒后,DNA刚开始复制,分离DNA,然后在碱中沉淀,变性,让新合成的单链和模板链分开,再用CsCl密度梯度离心,以沉降的快慢来确定片段的大小,再检测放射标记,结果表明被3H标记的片段,也就是新合成的片段,沉淀系数为20S左右,即都是长1000~2000Nt的DNA片段,而亲本链要比它大20~50倍;第二组实验是脉冲追逐实验.目的是检测早期合成的DNA片段以后的命运又是如何的?是依然如旧的短片段,还是连接成了长片段.这个实验是先进行标记培养30秒,以后除去同位素继续培养几分钟,再分离DNA在碱中沉淀,检测结果.先合成的(带标记)的DNA不再是短片段,而和总DNA的情况相似,沉淀系数为70S~120S较长的片段,这意味着刚开始合成的片段都是短片段,以后再连接成长片段,人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段(Okazakifragment).   由于这个实验的结果使得人们普遍认为:无论是前导链还是后滞链都是先合成小片段,然后在连成大片段,称为“不连续复制“(discontinuousreplication).然而由模型预测应该只有一半放射标记存在于小片段中,但实验的结果却全部是小片段DNA,为什么从前导链模板的3′-OH端延伸会不连续合成呢?人们在思考这个问题.1978年Olivera提出了半不连续(semidiscontinuous)复制模型,也就是说前导链上的合成是连续的,只有后滞链上的合成才是半连续的.现在已经弄清原来是由于细胞内都存在有dTTP和dUTP,而DNApolⅢ却并不能区分它们,因此也会将dUTP加入到DNA中,形成A·U对.那么在DNA中为什么没有U的存在呢?这是因为E.coli细胞里有双重“保险”,防止了U的“混入”.第一道关是细胞里的dUTPase,它能使dUTP变成dUMP,dUMP是不能作为DNA合成的底物,这样它就不再能加入DNA中.但总还有些漏网之“鱼”,它们还是逃过此关,混入DNA中,这就靠第二道关来清除“异己”,这道关的主角是尿嘧啶N-糖苷酶(uracilN-glycosylase),它可以切断混合尿苷的糖苷键,形成无Pu和Py位点(apurinicorapyrimidinic,AP),再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口,进一步进行切除修复.在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快,而AP酶作用较慢,在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U,但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键,在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了,用NaOH沉淀时,AP位点十分易断裂,所以前导链也成了小片段.以下实验证实了这个解释:   (1)在dut-突变体(dUTPase缺失)中冈崎片段比在dut+中为短.这是因为U掺入机会增加;   (2)在ung-(尿嘧啶N-糖苷酶缺失)突变体中,新合成的DNA约有一半由片段组成.这是(3)因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失,不会切除U的糖苷链,也就不会出现AP位点,所以碱沉淀时不易断裂,从而保持了半不连续的原貌.   在dut-,ung-双突变体中,结果和实验(2)相同,更进一步证实了此推测.
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